Microarrays del DNA in cosa consiste, procedura e applicazioni

un DNA microarray, detto anche DNA chip o DNA microarray, è composto da una serie di frammenti di DNA ancorati ad un supporto fisico di materiale variabile, sia di plastica che di vetro. Ogni pezzo di DNA rappresenta una sequenza complementare ad un gene specifico.

L'obiettivo principale dei microarray è lo studio comparativo dell'espressione di alcuni geni di interesse. Ad esempio, è comune che questa tecnica venga applicata a due campioni - uno in condizioni salutari e uno patologico - per identificare quali geni vengono espressi e quali non si trovano nel campione che presenta la condizione. Detto campione può essere una cellula o un tessuto.

Generalmente l'espressione dei geni può essere rilevata e quantificata grazie all'uso di molecole fluorescenti. La manipolazione dei chip viene eseguita nella maggior parte dei casi da robot e un gran numero di geni può essere analizzato simultaneamente.

Questa tecnologia innovativa è utile per una vasta gamma di discipline, dalla diagnosi medica a vari studi di biologia molecolare nei campi della proteomica e della genomica.

indice

• 1 Che cos'è?
  • 1.1 Tipi di microarray
• 2 Procedura
  • 2.1 Isolamento dell'RNA
  • 2.2 Produzione ed etichettatura del cDNA
  • 2.3 Ibridazione
  • 2.4 Lettura del sistema
• 3 applicazioni
  • 3.1 Cancro
  • 3.2 Altre malattie
• 4 riferimenti

Cos'è?

I microarrays del DNA (acido desossiribonucleico) sono un insieme di specifici segmenti di DNA collegati a una matrice solida. Queste sequenze sono complementari ai geni che desiderano essere studiati e possono esserci fino a 10.000 geni per cm².

Queste caratteristiche consentono lo studio sistematico e massiccio dell'espressione genica di un organismo.

Le informazioni che una cellula ha bisogno per il suo funzionamento sono codificate in unità chiamate "geni". Alcuni geni contengono istruzioni per la creazione di molecole biologiche essenziali chiamate proteine.

Un gene viene espresso se il suo DNA viene trascritto in una molecola intermedia di RNA messaggero e l'espressione del gene può variare a seconda del livello di trascrizione di questo segmento di DNA. In certi casi, il cambiamento nell'espressione può essere indicativo di malattie.

Il principio di ibridazione rende possibile il funzionamento dei microarray. Il DNA è una molecola composta da quattro tipi di nucleotidi: adenina, timina, guanina e citosina.

Per formare la struttura a doppia elica, l'adenina è raggruppata con timina e citosina con guanina. Quindi, due catene complementari possono essere collegate da legami idrogeno.

Tipi di microarray

Per quanto riguarda la struttura di microarray ci sono due varianti: il DNA complementare misura o microarrays oligonucleotidici e alta densità commerciale rilasciato da aziende commerciali quali Affymetrix GeneChip.

Il primo tipo di microarray permette l'analisi di RNA da due campioni differenti in un singolo chip, mentre la seconda variante è di tipo commerciale e ha un gran numero di geni (per esempio l'Affymetrix GeneChip ha circa 12.000 geni umani) analisi permettendo un singolo campione

processo

Isolamento dell'RNA

Il primo passo per eseguire un esperimento utilizzando la tecnologia microarray è l'isolamento e la purificazione delle molecole di RNA (può essere l'RNA messaggero o altri tipi di RNA).

Se si desidera confrontare due campioni (sani rispetto a quelli malati, controllo e trattamento, tra gli altri) deve essere effettuato l'isolamento della molecola in entrambi i tessuti.

Produzione ed etichettatura di cDNA

Successivamente, l'RNA viene sottoposto a un processo di trascrizione inversa in presenza di nucleotidi marcati e quindi si otterrà il DNA complementare o il cDNA.

L'etichettatura può essere fluorescente e deve essere differenziabile tra i due tessuti da analizzare. I composti fluorescenti Cy3 e Cy5 sono tradizionalmente utilizzati, poiché emettono fluorescenza a diverse lunghezze d'onda. Nel caso di Cy3 è un colore vicino al rosso e Cy5 corrisponde allo spettro tra arancione e giallo.

ibridazione

CDNA vengono mescolati e le sezioni sono state incubate in microarray di DNA per consentire ibridazione (cioè, si verifica vincolante) cDNA da entrambi i campioni con la porzione di DNA immobilizzato sulla superficie solida del microarray.

Una percentuale maggiore di ibridazione con la sonda nel microarray viene interpretata come una maggiore espressione tissutale del corrispondente mRNA.

Lettura del sistema

La quantificazione dell'espressione viene effettuata incorporando un sistema di lettura che assegna un codice colore alla quantità di fluorescenza emessa da ciascun cDNA. Ad esempio, se si usa il rosso per marcare la condizione patologica e si ibrida in maggiore proporzione, la componente rossa sarà quella predominante.

Con questo sistema è possibile conoscere la sovraespressione o la repressione di ciascun gene analizzato in entrambe le condizioni selezionate. In altre parole, è possibile conoscere il trascrittoma dei campioni valutati nell'esperimento.

applicazioni

Attualmente, i microarray sono considerati strumenti molto potenti nel campo della medicina. Questa nuova tecnologia consente la diagnosi di malattie e una migliore comprensione di come l'espressione genica viene modificata in diverse condizioni mediche.

Inoltre, consente il confronto tra un tessuto di controllo e un tessuto trattato con un determinato farmaco, al fine di studiare gli effetti di un possibile trattamento medico.

Per fare ciò, lo stato normale e lo stato malato vengono confrontati prima e dopo la somministrazione del farmaco. Quando si studia l'effetto del farmaco sul genoma in vivo hai una visione migliore del meccanismo di azione di esso. Inoltre, si può capire perché alcuni particolari farmaci portano a effetti collaterali indesiderati.

cancro

Il cancro guida l'elenco delle malattie studiate con i microarrays del DNA. Questa metosologia è stata utilizzata per la classificazione e la prognosi della malattia, in particolare nei casi di leucemia.

Il campo di ricerca di tale condizione comporta la compressione e la caratterizzazione delle basi molecolari delle cellule tumorali di trovare modelli di espressione genica che si traducono in errori nella regolazione del ciclo cellulare e processi di morte cellulare (apoptosi) o.

Altre malattie

Utilizzando microarray sono stati chiariti i profili di espressione differenziale di geni in condizioni mediche di allergie, immunodeficienze primarie, malattie autoimmuni (come l'artrite reumatoide) e le malattie infettive.

riferimenti

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