Ziehl-Neelsen Stain Foundation, Reagents and Technique

il Macchia di Ziehl-Neelsen in una tecnica colorante per identificare microrganismi resistenti agli acidi e agli acidi (AAR). Il nome di questa procedura di microbiologia si riferisce ai suoi autori: il batteriologo Franz Ziehl e il patologo Friedrich Neelsen.

Questa tecnica è un tipo di colorazione differenziale, che implica l'uso di diversi coloranti al fine di creare un contrasto tra le strutture che si desidera osservare, differenziare e successivamente identificare. La colorazione Ziehl-Neelsen serve a identificare determinati tipi di microrganismi.

Alcuni di questi microrganismi sono micobatteri (ad esempio,Mycobacterium tuberculosis), nocardias (ad esempio,Nocardia sp.) e alcuni parassiti unicellulari (ad esempio,Cryptosporidium parvum). Molti dei batteri possono essere classificati attraverso una tecnica comune chiamata colorazione di Gram.

Tuttavia, alcuni gruppi batterici richiedono altri metodi per identificarli. Tecniche come la colorazione di Ziehl-Neelsen richiedono combinazioni di coloranti con il calore per fissare il primo alla parete cellulare.

Quindi viene un processo di decolorazione che consente due risultati: resistenza o sensibilità allo scolorimento da parte di acidi e alcoli.

indice

• 1 Fondazione
  • 1.1 Colorazione secondaria
• 2 reagenti
  • 2.1 Colorazione primaria
  • 2.2 Soluzione decolorante
  • 2.3 Colorazione secondaria (anti-colorante)
• 3 Tecnica
  • 3.1 Procedura di colorazione acido-rapida
• 4 riferimenti

fondazione

La base di questa tecnica di colorazione si basa sulle proprietà della parete cellulare di questi microrganismi. Il muro è formato da un tipo di acidi grassi chiamati acidi micolici; Questi sono caratterizzati da catene molto lunghe.

Quando gli acidi grassi hanno strutture molto lunghe, possono trattenere i coloranti più facilmente. Alcuni generi di batteri sono molto difficili da colorare con la colorazione di Gram, a causa dell'alto contenuto di acido micolico della parete cellulare.

Nella colorazione di Ziehl-Neelsen si usa il composto fenolico carbol fuchsin, un colorante basico. Questo ha la capacità di interagire con gli acidi grassi nella parete cellulare, che è cerosa nella struttura a temperatura ambiente.

La colorazione di carbol fuchsin è migliorata in presenza di calore, perché la cera si scioglie e le molecole di colorante si muovono più rapidamente nella parete cellulare.

L'acido usato in seguito serve a scolorire le cellule che non sono state macchiate perché il loro muro non era sufficientemente correlato al colorante; pertanto, la forza del decoloratore acido è in grado di rimuovere la tintura acida. Le cellule che resistono a questa decolorazione sono chiamate resistenti agli acidi.

Colorazione secondaria

Dopo lo scolorimento del campione, questo è in contrasto con un altro colorante chiamato colorante secondario. Il blu di metilene o il verde malachite sono generalmente usati.

Il colorante secondario colora il materiale di fondo e, di conseguenza, crea contrasto con le strutture che sono state tinte nel primo passaggio. Solo le cellule sbiancate assorbono il secondo colorante (anti-macchia) e prendono il loro colore, mentre le cellule acido-resistenti mantengono il colore rosso.

Questa procedura è spesso utilizzata per l'identificazione di Mycobacterium tuberculosis e Mycobacterium leprae, che sono chiamati bacilli acido-veloci.

reagenti

Colorazione primaria

Viene utilizzato il carbossina allo 0,3% di fuchsin (filtrato). Questo colorante viene preparato da una miscela di alcoli: fenolo in etanolo (90%) o metanolo (95%), e in questa miscela vengono sciolti 3 grammi di fucsina basico.

Soluzione decolorante

In questa fase possono essere utilizzate soluzioni di acido alcolico al 3% o acido solforico al 25%.

Colorazione secondaria (anti-colorante)

Il colorante più comunemente utilizzato per eseguire il contrasto nei campioni è solitamente blu di metilene allo 0,3%. Tuttavia, puoi anche utilizzare altri, come lo 0,5% di verde malachite.

tecnica

Procedura di colorazione acido-rapida

Preparare uno striscio batterico

Questa preparazione viene effettuata su un vetrino pulito e asciutto, seguendo le precauzioni di sterilità.

Asciugare la macchia

Lasciare asciugare lo striscio a temperatura ambiente.

Riscalda il campione

Il campione deve essere riscaldato applicando il fuoco alla diapositiva sottostante. Una fissazione con alcool può essere effettuata quando lo striscio non è stato preparato con espettorato (trattato con ipoclorito di sodio per sbiancarlo) e se non verrà macchiato immediatamente.

M. tubercolosi Viene eliminato con la candeggina e durante il processo di colorazione. L'impostazione del calore dell'espettorato non trattato non uccide M. tubercolosi, mentre la fissazione con l'alcol è battericida.

Coprire la macchia

La macchia è coperta con la soluzione di carbol fuchsin (colorante primario di base).

Riscalda la macchia

Questo è fatto per 5 minuti. Si dovrebbe notare un rilascio di vapore (circa 60 ° C). È importante non surriscaldare ed evitare di bruciare il campione.

Per quanto riguarda il riscaldamento della macchia, è necessario prestare molta attenzione durante il riscaldamento del carbol fuchsin, specialmente se la colorazione viene effettuata su un vassoio o altro contenitore in cui sono stati raccolti prodotti chimici altamente infiammabili dalla colorazione precedente.

Applicare una piccola fiamma sotto i vetrini utilizzando un tampone illuminato precedentemente inumidito con alcune gocce di alcool acido, metanolo o etanolo al 70%. Evitare l'uso di un tampone grande imbevuto di etanolo perché questo è un pericolo di incendio.

Lavare la macchia

Questo lavaggio dovrebbe essere fatto con acqua pulita. Se l'acqua del rubinetto non è pulita, lavare preferibilmente lo striscio con acqua filtrata o distillata.

Coprire lo striscio con alcool acido

Questo alcol acido dovrebbe essere al 3%. La copertura viene effettuata per 5 minuti o fino a quando la macchia è sufficientemente scolorita, cioè rosa pallido.

Si deve tenere conto del fatto che l'alcol acido è infiammabile; pertanto, dovrebbe essere usato con molta attenzione. Evitare di essere vicino a fonti di ignizione.

Lavare la macchia

Il lavaggio deve essere effettuato con acqua pulita e distillata.

Coprire la macchia con la tintura

Può essere colorante verde malachite (0,5%) o blu metilene (0,3%) per 1 o 2 minuti, utilizzando il tempo più lungo se lo striscio è sottile.

Lavare la macchia

Di nuovo deve essere utilizzata acqua pulita (distillata).

drenare

La parte posteriore del vetrino deve essere pulita e la macchia deve essere collocata su un ripiano per il drenaggio, in modo che sia asciugata all'aria (non usare carta assorbente per asciugare).

Esamina lo striscio al microscopio

Dovrebbero essere utilizzati l'obiettivo 100X e l'olio per immersione. Analizza sistematicamente lo striscio e annota le osservazioni pertinenti.

Interpretare i risultati

Teoricamente, i microrganismi tinti di un colore rossastro sono considerati positivi all'acido-veloce (AAR +).

Al contrario, se i microorganismi sono macchiati di blu o di verde, a seconda della colorante usata come contro-colorante, sono considerati acidi resistenti all'alcol negativo (AAR-).

riferimenti

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